Kolanjiyokarsinoma Proliferasyonunun Otofaji ve Hedgehog Sinyal Yolaklarının İnhibisyonu ile Azaltılması

Abstract

Cholangiocarcinoma (CCA) is the second most common liver cancer type. The median survival rate of CCA patients is really low. Aberrant signaling pathways such as PI3K/AKT/mTOR pathway could be main drivers in CCA pathogenesis. Hedgehog (Hh) pathway is also dysregulated in several carcinomas including CCA. It regulates and crosstalks with autophagy, which is a lysosomal degradation process. There is no study showing the crosstalk between Hh pathway and autophagy in the context of CCA. Since both autophagy and Hh pathways are dysregulated in CCA, better understanding of how they crosstalk with each other and contribute to CCA pathogenesis is important. Considering this crosstalk between Hh pathway and autophagy, we conducted a combination treatment comprising Hh and autophagy pathway inhibitors in EGI-1 and TFK-1 CCA cell lines. In our study, we firstly checked anti-proliferative effects of Hh pathway inhibitor, GANT61, and different autophagy blockers using MTT and Annexin V assay and cell cycle analysis. After determination of IC30 of GANT61 (15 uM), chloroquine (25 uM for TFK-1 and 50 uM for EGI-1), and nocodazole (0.2 uM for EGI-1 and 0.4 uM for TFK-1), we conducted combination experiments. When we inhibit Hh pathway with targeting different steps of autophagy, we observed that proliferation of both EGI-1 and TFK-1 cells decreased compared to single treatments. After that, we checked the expression of autophagy-related LC3B protein and Akt, a negative regulator of autophagy, using western blotting after single treatments and combinational treatments. Based on the change in LC3B and Akt expression, we also concluded that, inhibition of autophagy with Hh pathway either induce or inhibit autophagy depends on the administered treatments. This study highlights the importance of deciphering the exact mechanisms that control autophagy in CCA, thus leading to better treatment.

Kolanjiokarsinoma (KKA) ikinci en yaygın karaciğer kanseri türü olarak bilinmektedir. KKA hastalarında hayatta kalma oranları olduça düşüktür. KKA patogenezinde PI3K/AKT/mTOR gibi sinyal yolaklarındaki bozuklukların temel mekanizmalardan biri olduğu düşünülmektedir. Hedgehog sinyal yolağının da KKA dahil birçok karsinogenezde bozulduğu daha önceki çalışmalarla gösterilmiştir. Hh sinyal yolağının lizozomal yıkım sürecinde rol alan otofaji sinyal yolağı ile de etkileşim halinde olduğu bilinmektedir. KKA patogenezinde Hh ve otofaji yolaklarındaki etkileşimin rolü bilinmemektedir. Bu yolaklarının KKA'da deregule edildiği de düşünülerek, bu iki sinyal yolağı arasındaki etkileşimin ve bu etkileşimin KKA patogenezindeki rolünün anlaşılması oldukça önemlidir. Bu çalışmada Hh ve otofaji yolakları arasındaki etkileşimi göz önünde bulundurarak EGI-1 ve TFK-1 hücrelerine otofaji ve Hh sinyal yolağı inhibitörlerini içeren bir kombinasyon muamelesi yapılmıştır. Çalışmamızda ilk olarak bir Hh inhibitörü olan GANT61'in ve farklı otofaji inhibitörlerinin antiproliferatif etkileri MTT, Annexin V ve hücre siklusu analizi ile ortaya konulmuştur. GANT61 (15 uM), chloroquine (TFK-1 için 25 uM ve EGI-1 için 50 uM), ve nocodazole (EGI-1 için 0.2 uM ve TFK-1 için 0.4 uM)'ün IC30 konsantrasyonları belirlendikten sonra, kombinasyon denemeleri yapılmıştır. EGI-1 ve TFK-1 hücreleri Hh inhibitörü ve otofaji yolağının farklı basamaklarını inhibe eden inhibitörlerle muamele edildiğinde, her iki kombinasyonda da hücre proliferasyonunun azaldığı gözlemlenmiştir.Hem tek bir inhibitörle hem de kombinasyonla muamele edilmiş hücrelerin otofaji bağlantılı LC3B ve otofajinin nefatif regülatörü olan Akt ifadesi western blot yöntemi ile incelenmiştir.LC3B ifadesi, Hh inhibisyonu ile birlikte otofajide hangi basamağın inhibe edildiğine bağlı olarak kombinasyonun otofajiyi tetiklediği ya da baskıladığını ortaya koymaktadır. Bu veriler CCA'da otofajiyi kontrol eden mekanizmaları ortaya koyarak, tedavisi için umut vadetmektedir.