Tasarlanmış Mikroorganizmalar ile Katma Değeri Yüksek Karotenoidlerin Biyosentezi

Abstract

Carotenoids are pigment molecules that play an important role in coloring plants, algae, and other organisms. These molecules exhibit various biological activities such as anticancer, antiviral and antioxidant activities. They have a huge market size and are mainly used in the food, feed, and cosmetic industries. The current supply chain for carotenoids is mostly relied on the extraction from plants and/or chemical synthesis for certain carotenoids. However, these strategies have various bottlenecks and disadvantages such as being affected by climate change, more difficult and costly extraction processes, and environmental issues. These can be overcome with microbial biosynthesis, which not only addresses the previous problems but also provides advantages of producing in a short time and scale-up for industrial production. In this research, we aimed to biosynthesize the high value-added carotenoids by engineered microorganisms. The genome of a native producer of zeaxanthin diglucoside, identified as endophytic Pseudomonas sp. 102515, was first edited by CRISPR-Cas9 to knock out zeaxanthin glucosyltransferase (CrtX), lycopene β-cyclase (CrtY) and beta-carotene hydroxylase (CrtZ). This led to ΔcrtX, ΔcrtY and ΔcrtZ mutant strains of Pseudomonas sp. 102515. On the other hand, overexpression plasmids carrying crtW, CaZEP and CaZEP-CaCCSm40 genes were constructed and transformed to ΔcrtX mutant to synthesize astaxanthin, violaxanthin and capsanthin/capsorubin. HPLC analysis of extracts from mutant strains and overexpression strains revealed that all the engineered strains produced the corresponding carotenoids such as zeaxanthin, β-carotene, and lycopene. Thus, this study paved the way for the biosynthesis of valuable carotenoids in the engineered endophytic bacteria.Karotenoidler, bitkiler, algler ve diğer organizmaları renklendirmede önemli rol oynayan pigment molekülleridir. Bu moleküller, antikanser, antiviral ve antioksidan aktiviteler gibi çeşitli biyolojik aktiviteler sergiler. Büyük bir market büyüklüğüne sahiptirler ve ağırlıklı olarak gıda, yem ve kozmetik endüstrilerinde kullanılırlar. Karotenoidlerin mevcut tedarik zinciri, çoğunlukla bitkilerden ekstraksiyon ve/veya belirli karotenoidler için kimyasal senteze dayanır. Ancak, bu stratejiler iklim değişikliğinden etkilenme, daha zor ve maliyetli ekstraksiyon süreçleri ve çevresel sorunlar gibi çeşitli kısıtlamalar ve dezavantajlara sahiptir. Mikrobiyal biyosentez bu sorunları aşmak ve aynı zamanda kısa sürede, endüstriyel ölçekte üretim için avantajlar sağlayan etkili bir yöntemdir. Bu araştırmada, genetik olarak tasarlanmış mikroorganizmalar kullanarak yüksek katma değerli karotenoidleri biyosentezle üretmeyi amaçladık. Doğal bir zeaksantin diglukozit üreticisi olarak keşfedilmiş endofitik Pseudomonas sp. 102515'in genomu, CRISPR-Cas9 ile düzenlenerek zeaksantin glukoziltransferaz (CrtX), likopen β-siklaz (CrtY) ve β-karoten hidroksilaz (CrtZ) genleri nakavt edildi. Pseudomonas sp. 102515'in ΔcrtX, ΔcrtY ve ΔcrtZ mutant suşları elde edildi. Diğer yandan, crtW, CaZEP ve CaZEP-CaCCSm40 genlerini taşıyan aşırı ekspresyon plazmidleri oluşturuldu ve ΔcrtX mutantına astaksantin, violaksantin ve kapsantin/kapsorubin sentezlemek üzere transforme edildi. Mutant suşlardan ve aşırı ekspresyon suşlarından elde edilen ekstraktların HPLC analizi, genetik olarak tasarlanmış suşların zeaksantin, β-karoten ve likopen gibi ilgili karotenoidi ürettiğini ortaya koydu. Böylece, bu çalışma, genetik mühendislik ile endofitik bakterilerde değerli karotenoidlerin biyosentezi için bir yol açtı.